Curva di crescita

 

Conteggio delle cellule con il contatore automatico (Coulter Counter)

Si è presa in considerazione la linea cellulare HL60, una linea leucemica umana che vive in sospensione ovvero, sono cellule che vivono sospese nel terreno completo al 10% (v/v) di FCS che contiene:

  • 10 mL           FCS (Fetal Calf Serum);
  • 1 mL              L-glutammina 200 nM;
  • 1 mL              penicillina/streptomicina (10.000 U/mL e 10.000 mg/mL);
  • 88 mL           terreno RPMI1640;

Queste ultime vivendo in sospensione possono essere contate facilmente con il contatore automatico (vedere tabella sottostante).
Nei giorni dal 26 Novembre al 29 Novembre tramite il contatore automatico, si sono contate le cellule HL60 per registrarne l’incremento.
Ecco i risultati:

Data
Ora
Cell/mL

26/11/2007

12.00

130000

27/11/2007

17.00

319280

28/11/2007

18.30

715880

29/11/2007

15.00

1599540

03/12/2007

15.00

2419960

 

È da notare che il conteggio registrato il 3 Dicembre è relativo all’ingresso delle cellule in un particolare fase detta “fase di Plateau”, nella quale in seguito all’aumento eccessivo del loro numero, le cellule non si duplicano più, pertanto la crescita si stabilizza su un valore che diminuisce con il diminuire dello spazio disponibile nel terreno di coltura e con il diminuire dei fattori di crescita.
Rappresentando graficamente i risultati della tabella si ha una curva che è destinata ad abbassarsi sempre più fino arrivare ad un valore uguale a zero, valore che coincide con la morte di tutte le cellule.

 

Graficando il logaritmo del numero di cellule ottenute nel primo grafico e facendone l’interpolazione, si ottiene una retta:

 

 

TEMPO

 

0

29

54,5

75,0

n cell/mL

319280

715880

1599540

2419960

log n cell/mL

5,5

5,85

6,2

6,38

 


 

Conteggio delle cellule con la camera di kova



Le HL60  si possono contare anche tramite la camera di kova, un vetrino di plastica costituito da 10 camere di conta. Ogni camera di conta contiene 9 quadrati a loro volta suddivisi in altri 9 quadratini più piccoli. In tutto ci sono 81 quadratini come si vede dalla figura.
Per poter identificare le cellule vive e le cellule morte, il preparato viene colorato con il trypan blue, un colorante che diffonde nelle membrane danneggiate (quindi quelle delle cellule morte) e permette di diversificare cellule morte, colorate di blu intenso, e cellule vive che dovranno essere contate.
La camera di kova viene riempita di cellule di cui se ne conosce la diluizione (20mL di Trypan e 20mL di cellule) con una micro pipetta. Il volume contenuto in tutta la superficie della camera è di 0,9 mL mentre il volume contenuto in un singolo quadratino è di 0,011 mL.
Per calcolare quante cellule sono contenute in 1 mL di soluzione si sono svolte le seguenti operazioni:

  • si contano le cellule dell’intera camera (81 quadratini) = Ntot;
  • si esegue la seguente operazione:


Per ottenere un risultato più soddisfacente io personalmente ho svolto i calcoli in due modi e poi ho fatto la media dei risultati.

 

 

torna su

 

Checchi Marta - Barbara Commisso

 

 

Curva di crescita

Tempo di duplicazione

Congelamento e scongelamento

Tripsinizzazione

Colorazioni

Citofluorimetria

Download